化学计量学在液相色谱法分析药物中的应用

摘要:液相色谱法是药物定性定量分析的常用方法,但在复杂体系的分离分析方面有其局限性。而化学计量学算法涉及数学、统计学和计算机科学,可以处理大量复杂数据和提取有用信息,所以近年来与液相色谱法结合分析药物已成为一个热点课题。在色谱条件优化、色谱无法分离的复杂多组分样品的“数学”分离、定性定量分析方面有良好的应用前景。

关键词:化学计量学; HPLC;药物分析

现代药物分析和质量控制主要采用以仪器分析为主的分析技术,其中高效液相色谱(HPLC)法作为近代分析中发展最快、应用最广的分离分析技术,具有高选择性、高灵敏度的特点,广泛应用于人工合成药物成分的定性定量测定、中草药有效成分的分离和纯度测定、药物代谢物的测定等方面。但是对于难分离的多组分样品,色谱法的局限性就体现出来,准确的定性和定量都是难以完成

化学计量学是一门新兴学科,它是运用数学、统计学、计算机科学以及其他相关学科的理论与方法,优化化学量测过程,并从化学量测数据中最大限度地提取有用的化学信息,是化学、分析化学与数学、统计学及计算机学科之间的“接口”,其应用己涉及到药物分析的所有领域,在液相色谱法中的应用尤为广泛。现将近年来化学计量学结

合HPLC法在药物分析中的应用综述如下。 1 液相色谱条件优化

药物分析色谱条件优化的步骤一般是,先确定液相色谱分离药物的若干个主要的影响因素变量[ 1, 2 ] ,根据初始条件和所获得的响应值,运用化学计量学算法对优化条件进行预测,最终得到最佳色谱条件。较早的色谱优化方法如单纯形法,最早由spendley提出,改进后的加权形心单纯形(WCM) 、控制加权形心单纯形(CWCM) 、智能搜索的单纯形等方法,已大大改善了搜索效率,曾被用来优化多种磺胺类药物的色谱分析系统。但这种方法不管分离条件与优化指标之间的关系,只根据优化指标的大小来搜索优化条件的方法,仍需要做很多实验,并且常常只能找到局部而非全局最优条件。更高级的优化方法先确定优化指标和色谱响应函数,用数学模型直接拟合优化指标和色谱参数之间的关系。如GaoRY等使用重叠分辨率图方法优化手性药物的分离条件

[ 3 ]

;单亦初等根据保留值方程模拟组分的分离情况,计算出串行色谱

响应函数的响应值,各种组分的保留情况以及相互之间的分离度进行分组,预测出优化的梯度洗脱条件分离分析芳香胺和氨基酸,用OSRM法[ 4 ]快速求得川芎等复杂样品的最佳多台阶梯度分离条件;张明锦建立了参数CE (色谱峰数目、相对峰面积之和以及平均分离度的经验参数)体现色谱检测的能力,经优化得到中药秦艽HPLC指纹图谱分析最佳的检测波长[ 5 ]。随着色谱技术的发展和应用范围的不断拓宽,各参数值之间存在复杂的非线性关系,很难用传统的方法对这些参数进行同时优化,因此遗传算法和人工神经网络被引入进来。遗传算法曾被

成功地用于肽类等色谱分离分析条件优化[ 6 ] ;人工神经网络被用于氨基酸、抗菌药物混合物、镇静催眠类药物等的液相色谱系统中流动相强度、pH值及梯度斜率等条件的优化[ 7 ] ,具有抗干扰能力强、容错性高等特点,能显著减少用于寻找最佳分离条件的实验次数。 2 药物色谱峰纯度判别与峰定性 2. 1 相关度计算法

液相色谱虽然有强的分离能力,但对某些极性相似的多组分药物及其杂质,各成分的色谱峰是否能在系统中完全分离以及分离开的色谱峰的定性,一直是色谱分析工作者首要关注的问题。采用光谱相关度比较可有效地判断峰纯度并鉴别多组分样品峰[ 8 ] ;在全波长范围内比较标准光谱矢量与样品光谱矢量之间的相关性可获得更精确的定性结果,据此发展的光谱相关色谱技术已成功地用于对冬虫夏草等中药成分的归属分析[ 9 ]、中药决明子色谱峰纯度的鉴别[ 10 ]等;Matthias Herzler等建立了2682 种物质的200nm～380nm波长范围的DAD光谱库用于定性分析[ 11 ] ; 而色谱二维光谱相关法[ 12 ] ,甚至对重叠严重的色谱峰也能作出准确判断,可用于对色谱图中药物杂质进行快速识别,在多种复杂成分的识别方面也有很大的应用潜力。 2. 2 因子分析法

对于有未知组分数和各组分浓度的“灰色和黑色体系”,解析重叠色谱峰纯度与组分数的方法大多基于主成分分析[ 13 ]或因子分析方法。一般二维数据矩阵Y由w个不同波长下测得洗脱过程中s个吸收光谱组成。单个光谱代表Y的一个行矢量,它相当于w维空间的点,同一光

谱应重合在同一点,或者仅是矢量长度不同,所以由奇异值等分解方法分解出的线性独立的矢量数就是体系中的组分数。比较有代表性的渐近因子分析法( EFA) ,交互移动窗口因子分析法(AMWFA) [ 14 ] ,固定尺寸移动窗口渐进因子分析法(FSMWETA)等,该类方法利用主成分分析所得的特征值为其基本出发点,逐步渐进地延拓至整个矩阵,从而得到各物种在该数据矩阵中的出现点和消失点。而固定局部窗口尺寸和移动方向,大大节省了对整个矩阵的运算时间,不仅可以判断峰纯度,还能给出组分数的信息。 3 复杂药物重叠色谱峰定量

为获得准确的色谱定量结果,有时需对仪器采集的信号进行处理,如用Savitzky - Golay多项式平滑方法、傅立叶变换、小波变换、谱图叠加法等增加信噪比,这类技术有些已被色谱仪生产商整合进色谱工作站软件中。

在HPLC法进行多组分药物分析时,样品中各组分未完全分离的情况非常普遍。较早的化学计量学方法用作一维色谱(单通道检测)时,对那些没有完全分离的组分色谱峰常采用垂直切割等方法作近似处理,假设色谱峰的形状,一般用高斯峰、EMG模型或其他经验机理的模型确定峰形,再定量峰面积,这样不可避免地引入了人为判断的误差和模型误差。但随着分析仪器的发展,目前较常用的二维或高维色谱数据(如HPLC - DAD, HPLC - MSn )中,由于有了更多信息,不必依赖这些假设,从而更为客观地解析原始数据并重建色谱信息。借助化学计量学中的多元分辨技术对高维数据样本进行处理,分辨重叠峰,可以得到

各组分的纯色谱和纯光谱曲线,从而实现对多组分混合峰的定量。如改进的非负矩阵因子分解算法[ 15 ] 被用于盐酸舍曲林及其对映异构体重叠峰分析[ 16 ] ,正交投影法被用于解析茶碱等重叠色谱峰; Lopez2Mar2tinez等人用基于主成分分析的偏最小二乘( PLS) 法结合HPLC2DAD实现了对咖啡和茶叶样品中咖啡碱和可可碱的同时测定

[ 17 ]

;Wiberg等采用PLS回归对利多卡因进行了快速测定[ 18 ]。基于光谱

分辨自模式曲线法基本思想的渐进因子分析法( EFA) 、迭代目标转换因子分析法( ITTFA) ,直观推导式演进特征投影(HELP) 等法均曾被用于HPLC - DAD 测得的重叠药物色谱数据分辨[ 19 ] ,其中EFA不适用于色谱重叠度大的体系;而HELP法被广泛用于复杂中药成分如冬虫夏草的化学成分测定、枸杞子中的类胡萝卜素等, 李玮等曾用HELP法分辨庆大霉素C组分色谱图[ 20 ] ,并将解析结果的准确性用ELSD测定、柱切换等方法进行了验证。HELP法充分利用了色谱中的选择信息,效果优于EFA和ITTFA,但它的缺点是:对于无选择性区域的、左右完全被包合的色谱峰无法解析。其他算法如立方阵三线性分解[ 21 ] ,小波变换、人工神经网络等也曾被应用在药物色谱重叠峰定量中。人工神经网络法的准确度与两峰重叠程度无关,用训练好的网络对两重叠峰进行预测工作量大大缩小,但此法还存在一定缺陷,如对多组分分离时,网络必须设置得很大。小波变换法具有较强的逼近、容错能力,不仅谱图重构结果好,还可以用小波进行高频噪声的滤过。

尽管对于重叠色谱峰的分辨已有多种化学计量学算法出现,但对于各组分峰面积差别悬殊的情况,仍无满意的方法对小组分峰准确定

量;而且对于重叠的多组分,用“组分剥离”法每分辨出一个有效组分后,噪声都会叠加在分辨后的残余矩阵,为下一个组分的分析带来困难,这意味着组分越多,后分辨出的峰定量准确度越差,而采用滤噪方法又会致使有用信息的损失。 4 中药色谱指纹图谱分析

目前,色谱是中药指纹图谱分析的主要手段,它能将多种分离模式结合,还可从不同角度探讨中药的化学组成及其与疗效的关系,而指纹图谱的评价主要是依托化学计量学方法来完成。如完整的指纹图谱或色谱峰高、峰面积的相似性计算方法,用来表征矢量间的形状差异和变化趋势,已成功地应用于中药的质量评价[ 22, 23 ] ,有关相似度计算方法夹角余弦、相关系数等算法改进的报道也很多[ 24 ] 。用化学模式识别分析方法可按中药的化学成分、图形图像以及DNA 序列等对中药进行分类评价[ 25 ] 。无监督的模式识别方法用谱图信息对样本进行归类;有监督的模式识别方法用于建立类别间的数学模型,使各类样品间达到最大的分离,并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。较为常用的模式识别算法有主成分分析法( PCA) [ 26 ] ,非线性映照法(NLM) ,线性学习机法,人工神经网络(ANN)等[ 27 ] 。最近Yu Yan等[ 28 ]利用药物以及抗生素作用于金黄色葡萄球菌的代谢产物的指纹图谱,结合主成分分析法得到了尖萼耧斗菜可能的抗菌模式和特征的生物活性成分,该方法将色谱指纹图谱与中药的作用机理研究结合起来,为更有效地分析评价中药质量开辟了新的途径。 5 结语

化学计量学在实验设计、数据处理、信息分析等方面具有巨大优势,近年来在药物分析领域的应用也取得了很大成功。如整合了多种化学计量学方法构建的高效液相色谱专家系统等的应用,大大提高了分析效率,药物定性定量的准确性也得到了提高。而随着液相色谱分析技术的飞速发展,采用现代仪器分析得到的药物信息量也越来越大,只有采用化学计量学的方法能寻找特征信息并进行处理,解决复杂药物分离分析难题,同时这些方法也为新型高维液相色谱联用仪器的构建、药物分析智能化提供了新的思路。

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