HPLC法测定末梢血中苯丙氨酸与酪氨酸及在苯丙酮尿症中的应用

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２０　现代检验医学杂志第２３卷第４期２００８年７月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．４，Ｊｕ１．２００８　ＨＰＬＣ法测定末梢血中苯丙氨酸与酪氨酸及在苯丙酮尿症中的应用。　莫喜明，唐爱国　（中南大学湘雅第二医院检验科，长沙４１００１１）　摘　要：目的　建立一种简单、快速的反相高效液相色谱法测定末梢血液中的苯丙氨酸（Ｐｈｅ）与酪氨酸（Ｔｙｒ）并用于苯丙　酮尿症（ＰＫＵ）的筛查。方法　末梢血标本与等量５　（ｖ／ｖ）高氯酸溶液混合处理去除蛋白后离心取上清液２Ｏ　１直接进样　分析。用Ｈｙｐｅｒｓｉｌ　Ｃ８色谱柱（６．０ｍｍ×３００ｍｍ，１０　ｍ）分离，流动相为乙腈一水（体积比５：９５），流速１．５　ｍｌ／ｍｉｎ，紫外检测　波长２１０　ｎｍ，室温下测定。结果　末梢血中Ｔｙｒ和Ｐｈｅ均分离良好，保留时间分别为５．８８　ｍｉｎ和８．４３　ｍｉｎ。１Ｏ２例健康儿　童指血Ｐｈｅ浓度６７．７士１５．４￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｔｙｒ浓度为６２．２士１３．９￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比值为１．１５士０．２７。３２例正常新生儿足跟　血Ｐｈｅ浓度为６６．２士２Ｏ．５￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｔｙｒ浓度为５９．５士１８．８￣ｍｏｌ／Ｌ，Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比值为１．１２士０．２４。结论　该法灵敏度高，　特异性好，方法简便快速，成本低廉，适合于末梢血中Ｐｈｅ和Ｔｙｒ的同时测定及ＰＫＵ的筛查与监控。　关键词：高效液相色谱；苯丙氨酸；酪氨酸；苯丙酮尿症；新生儿筛查　中图分类号：Ｒ７２２．１１；Ｑ５０３　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７１—７４１４（２００８）０４—０２０—０４　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｂｌｏｏｄ　ｂｙ　ＨＰＬＣ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｈｅｎｙｌｋｅｔ０ｎｕｒｉａ　ＭＯ　Ｘｉ—ｍｉｎｇ，ＴＡＮＧ　Ａｉ—ｇｕｏ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｘｉａｎｇｙａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４　１　００　１　１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ａｎｄ　ｒａｐｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈ—　ｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｂｙ　ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＲＰ—ＨＰＬＣ），ａｎｄ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｎｅｏｎａｔａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙ１ｋｅｔｏｎｕｒｉａ（ＰＫＵ）．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｆｌｕｉｄ　ｏｆ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｅｒ—　ｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｗａｓ　ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ　ｅｌｕｔｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｂａｓｅ—ｄｅａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｃ８　ｃｏｌｕｍｎ　ｗｉｔｈ　５％（ｖ／ｖ）ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ａｓ　ｔｈｅ　ｍｏｂｉ１　ｐｈａｓｅ．Ｕｎｔｒａｖｌｏｌｅｔ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ　ｗｏｒｋｅｄ　ａｔ　２１　０　ｎｌＴ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｅ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ（Ｔｙｒ）ａｎｄ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｐｈｅ）　ｗｅｒｅ　５．８８　ｍｉｎ　ａｎｄ　８．４３　ｒａｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｐｈｅ　ａｎｄ　Ｔｙｒ　ｉｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　１０２　ｈｅａｌｔｈ　ｅｎｆａｎｔ　ｗｅｒｅ（６７．７士１５，４）ｇｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ　（６２．２士１３．９）ｇｍｏｌ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｐｈｅ／Ｔｙｒ　ｗａｓ　１．１５士０．２７．Ｐｈｅ　ａｎｄ　ｒ　ｉｎ　ｈｅｅｌ　ｂｌｏｏｄ　ｏｆ　３２　ｈｅａｌｔｈ　ｎｅｏｎａｔａ１　ｗｅｒｅ（６６．２士２０．５）ｇｍｏｌ／Ｌ　ａｎｄ（５９．５士１８．８）ｇｍｏｌ／Ｌ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　Ｐｈｅ／Ｔｙｒ　ｗａｓ　１．１２士０．２４．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ｗｈｏｌｅ—ｂｌｏｏｄ　ｗｈｉｃｈ　ａｎｔｉｃｏｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＥＤＴＡ—Ｋ２　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｓｔａｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ａｎｔｉｃｏｇｕｌａｔｉｎｇ　ｂｙ　ｈｅｐａｒｉｎ（Ｐ＞０．０５）．Ｔｈｅ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｗｅｒｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈｏｓｅ　ｉｎ　ｐｌａｓｍａ，ｂｕｔ　ｓｈｏｗｅｄ　ａ　ｇｏｏｄ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ．Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ｗｈｏｌｅ—ｂｌｏｏｄ　ｗｈｉｃｈ　ｓｔｏｒａｇｅｄ　ｉｎ　ｆｒｏｓｔ　ｗｅｒｅ　ｍｏｒｅ　ｓｔａｂｉｌ　ｉｔｙ　ｉｎ　ｏｎｅ　ｗｅｅｋ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｓ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ａｃｃｕｒａｔｅ，ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｓｉｍｐｌｅ　ｉｎ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｉｎ　ｆｉｎｇｅｒ　ｂｌｏｏｄ．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｈｉｇｈ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ；ｔｙｒｏｓｉｎｅ；ｐｈｅｎｙ１ｋｅｔｏｎｕｒｉａ；ｎｅｏｎａｔａｌ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　苯丙氨酸（Ｐｈｅ）和酪氨酸（Ｔｙｒ）属于芳香族　例，年龄为２月～７岁，平均年龄３．２岁）。研究对　氨基酸，是机体合成各种蛋白质、神经递质的重要　象在上午７～９时采取末梢血液８０／，１于装有ＥＤ—　前体物质，在苯丙酮尿症（ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ，　ＴＡ—Ｋ：固体抗凝剂的采血管内（湖北金杏科技发　ＰＫＵ）、白化病等遗传代谢性疾病的诊断、治疗和　展有限公司产品），充分混匀。②正常新生儿标本　监测中其浓度测定具有十分重要的临床意义ｌ１］。高　组：２００７年３～４月在我院顺产各指标正常的新生　效液相色谱法可准确、快速地定量测定血液中的　儿，出生４８　ｈ后，哺乳２次以上，采集６Ｏ　ｌ足跟血　Ｐｈｅ和Ｔｙｒ含量，但国内外多采用静脉血标本进行　于装有ＥＤＴＡ—Ｋ：固体抗凝剂的采血管内，充分混　检测。手指采血简便、快捷，患儿易于接受，便于长　匀，共３２例（其中男１９例，女１３例），来自本院妇　期监控时反复检测。本文报道采用ＨＰＩ　Ｃ一紫外法　产科。⑧分析影响因素探讨组：随机采取本院住院　测定微量指血中的Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度。　或门诊病人。　１对象和方法　１．２主要仪器及试剂　１．１　对象①正常儿童组：２００６年５月～１Ｏ月来　１．２．１仪器：美国Ｗａｔｅｒｓ公司ＰＣ８００型高效液　本院体检的正常儿童１０２例（其中男５８例，女４４　相色谱仪，包括Ｍ５１０泵，Ｍ４８６紫外检测器，　＊基金项目：湖南省科技厅资助项目（０４ＳＫ３０５２）。　作者简介：莫喜明（１９７７一），男，湖南长沙人．硕士，主管技师，Ｔｅｌ：ｌ３５７４８５４８８０。　维普资讯 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现代检验医学杂志第２３卷第４期２００８年７月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．４，Ｊｕ１．２００８　２１　ＭＴ１２５　Ｒｈｅｏｄｙｎｃ进样阈（定量环２０　１）及ＰＣ８００　色谱工作站；美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ—Ｑ纯水　机，ＴＧＬＬ一１８台式冷冻离心机。　１．２．２主要试剂及配制：Ｉ　一苯丙氨酸（Ｐｈｅ），Ｌ一酪　（Ａ）作回归分析，回归方程为：Ａ一６　０８２．７Ｃ一２５　４４４，ｒ一０．９９８　９。Ｔｙｒ标准溶液在５．５～１　２５０　￣ｍｏｌ／Ｌ范围内，回归方程为：Ａ＝４　６７９．１Ｃ一１５．　１，ｒ一０．９９９　９，均示线性良好。以信噪比（Ｓ）等于３　时求出Ｐｈｅ和Ｔｙｒ的最低检测限分别为１．５　＃ｍｏｌ／Ｌ和１．０＃ｍｏｌ／Ｌ。　氨酸（Ｔｙｒ）购于Ｓｉｇｍａ公司；乙腈（色谱纯）美国　Ｔｅｄｉａ公司；高氯酸（优级纯）；冰乙酸（分析纯）。　１．２．３标准溶液的配制：①６　１００￣ｍｏｌ／Ｌ　Ｌ—Ｐｈｅ　和５　５００￣ｍｏｌ／Ｌ　Ｌ—Ｔｙｒ标准储存液：分别取Ｐｈｅ　和Ｔｙｒ标准品各１０．０　ｍｇ用２．５　（ｖ／ｖ）高氯酸溶　液溶解后各自定容至１０．０　ｍｌ混匀，分装储存于一　２０℃冰箱备用。使用前稀释成６１０，６１．０　ｇｍｏｌ／Ｌ　Ｉ　一Ｐｈｅ和５１０，５１．０￣ｍｏｌ／Ｌ　Ｌ—Ｔｙｒ的应用液。②混　合标准应用液：２．５　（ｖ／ｖ）高氯酸溶液配制混合标　准应用液，终浓度为Ｐｈｅ（６１．０￣ｍｏｌ／Ｌ）和Ｔｙｒ　（５５．０￣ｍｏｌ／Ｌ）。　１．３　分析方法　４０　ｌ全血加入到盛有等体积　５　（ｖ／ｖ）高氯酸蛋白沉淀剂的ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管内，旋　涡混匀３０　ｓ后室温放置１０　ｍｉｎ，然后１０　０００　ｒ／ｍｉｎ　离心５　ｍｉｎ，取上清３５　ｌ再次１０　０００　ｒ／ｍｉｎ离心５　ｍｉｎ，取上清２０　ｌ进样。色谱条件：色谱柱为Ｈｙ—　ｐｅｒｓｉｌ　Ｃ８柱（６．０ｍｍ×３００ｍｍ，１０　ｍ，大连依利特　科学仪器有限公司）；流动相为５　（ｖ／ｖ）乙腈；流　速１．５　ｍｌ／ｍｉｎ；等度洗脱；紫外检测波长２１０　ｎｍ；　室温；进样量２０　ｌ。Ｐｈｅ和Ｔｙｒ峰的定性、定量及　统计学处理：Ｐｈｅ和Ｔｙｒ峰采用峰保留值比较法和　叠加法定性分析，用外标法测峰面积进行定量分　析，结果用　±Ｓ表示，统计分析均由ｓｐｓｓｌ１．５统　计软件包完成。　２　结果　２．１　标准品、正常儿童末梢血样品、ＰＫＵ患儿末　梢血样品的色谱分离图　分别见图１，２，３。混合标　准品、正常儿童末梢血样品、ＰＫＵ患儿末梢血样品　的色谱分离，１０　ｍｉｎ内分离完毕，Ｔｙｒ和Ｐｈｅ均分　离良好，保留时间分别为５．８８　ｍｉｎ和８．４３　ｍｉｎ。　【乜　压　＾　微　伏　图１标准品色谱图　２．２　标准曲线和检测限Ｐｈｅ标准溶液在６～１　５１２￣ｍｏｌ／Ｌ范围内，以浓度（ｃ）对其相对的峰面积　电　压　＾　微　伏　０　图２正常儿童末梢血样品色谱图　电　压　＾　微　伏　图３　ＰＫＵ患儿末梢血样品色谱图　２．３精密度和回收率试验将相同血型的混合全　血分为２０份同一批连续测定，计算批内ＣＶ，将同　一混合全血再分成２０份冰冻保存，每天取一份测　定，计算批间ＣＶ。Ｐｈｅ的批内与批间精密度分别为　３．２　与５．４　，Ｔｙｒ的批内与批间精密度分别为　２．６　与４．６　。向１０份已知Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度（分　别为７３．５￣ｍｏｌ／Ｌ和６５．６￣ｍｏｌ／Ｉ　）的混合同型全　血中加入用生理盐水释稀的Ｐｈｅ和Ｔｙｒ标准品　（加入浓度分别为Ｐｈｅ　６１．０￣ｍｏｌ／Ｉ　，Ｔｙｒ　５５．０　￣ｍｏｌ／Ｉ　），测得其平均回收率Ｐｈｅ为９８．２　，Ｔｙｒ　为９８．８　。　２．４干扰试验将９８．０￣ｍｏｌ／Ｉ　Ｌ－色氨酸，１０３．　４￣ｍｏｌ／Ｌ　５－羟色胺，２５６￣ｍｏｌ／Ｉ　肌酐，７６５￣ｍｏｌ／　Ｉ　肌酸加入正常全血标本中，未见对测定有影响的　干扰峰出现。　２．５　不同抗凝血Ｐｈｅ，Ｔｙｒ浓度比较　为了探讨　使用不同抗凝剂时抗凝血中的氨基酸浓度是否有　差异，选择了临床上常用的肝索和ＥＤＴＡ—Ｋ。两种　抗凝剂进行比较，分别测定了４１例肝索抗凝全血　维普资讯 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２２　现代检验医学杂志第２３卷第４期２００８年７月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．４，Ｊｕ１．２００８　与ＥＤＴＡ—Ｋ：抗凝全血的Ｐｈｅ（分别为６８．４±　１８．１，６７．２±１４．８／２ｍｏｌ／Ｌ）和Ｔｙｒ（６１．３±１３．５，　６２．７±１５．６￣ｍｏｌ／Ｌ）浓度。结果显示，这两种不同　的抗凝剂抗凝后所测得的全血中的Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓　度经配对ｔ检验无统计学差别（Ｐ—ｏ．７２５，Ｐ一０．　８３３），说明这两种抗凝剂都是适用的，但由于肝素　相对成本稍高，况ＥＤＴＡ—Ｋ：经验证不干扰测定，　故选择更为常用的ＥＤＴＡ—Ｋ：。　２．６　血浆、血清、末梢血中Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度比较　为探讨血浆、血清、末梢血中Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度是　否存在差异，选择了１ｏ例正常人，１０例肝病患者，　同时测定了其血清、ＥＤＴＡ—Ｋ：抗凝血浆及末梢血　内三者的浓度，结果，血清、血浆内的Ｐｈｅ（８０．４±　１８．６，７９．５±２Ｏ．７￣ｍｏｌ／Ｉ　）和Ｔｙｒ（７１．３±２０．７，　７１．８±２２．５￣ｍｏｌ／Ｌ）浓度二者无差别（Ｐ一０．８３５，　＞０．０５），但明显高于末梢血（Ｐｈｅ７３．１±１５．７　／２ｍｏｌ／Ｉ　，Ｔｙｒ６５．２±１６．３￣ｍｏｌ／Ｉ　）（Ｐ＜０．０５）。血　浆与末梢血二者经相关性检验，相关系数ｒ分别达　０．９９４（Ｔｙｒ）与０．９８１（Ｐｈｅ），相关明显（二者都有Ｐ　一０．０００）。经回归分析，Ｐｈｅ末梢血一０．９４６Ｐｈｅ血浆一　２．０９６，Ｔｙｒ，￣血一０　Ｔｙｒ血浆一４．２１５（－－者都有　Ｐ一０．０００）。　２．７　温度与保存时间对测定结果的影响　分别测　试４１例ＥＤＴＡ—Ｋ：抗凝全血标本在室温（２５±　１）℃，４℃保存条件下０，２４，７２，１２Ｏ，１６８　ｈ及一２Ｏ　℃冰冻保存１　ｗ后Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度随时问变化的　趋势。其结果如图４，５。结果表明，在冰冻保存条件　下，１　ｗ后冻溶再进行检测，Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度变化　无统计学意义（Ｐ值分别为０．７３２与０．５８６）。在４　℃保存条件下，Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度有逐步上升的趋　势，但在１２０　ｈ内基本保持稳定（Ｐ值分别为０．４２５　与０．２１７），到第７　ｄ明显升高（Ｐ＜０．０５）。在室温　下保存，测定结果改变明显。在２４　ｈ内Ｐｈｅ和Ｔｙｒ　浓度尚无明显变化（Ｐ值分别为０．５３６与０．３０８），　在７２　ｈ后明显上升（Ｐ＜０．０５），说明在室温下及时　测定的必要性，对待检标本进行及时处理是得到可　靠结果所必需的。　图４　不同温度下保存时间对全血Ｐｈｅ浓度的影响　图５　不同温度下保存时间对全血Ｔｙｒ浓度的影响　２．８正常标本的测定　２．８．１　正常儿童指血Ｐｈｅ，Ｔｙｒ和Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比值　测定：按本法测得１Ｏ２例（其中男５８例，女４４例，　年龄为２月～７岁，平均年龄３．２岁）各项体检指　标正常的儿童指血中Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度，结果见表　１。统计分析表明指血中Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度无性别差　异（Ｐ值分别为０．５０９和０．３９４）。　表１　健康幼儿末梢血Ｐｈｅ和Ｔｙｒ￣（ｕ，ｍｏｌ／Ｌ，ｎ＝１０２）　２．８．２健康新生儿足跟血Ｐｈｅ，Ｔｙｒ和Ｐｈｅ／Ｔｙｒ　比值测定：共收集了我院顺产各指标正常，出生４８　ｈ后，哺乳２次以上的新生儿足跟血３２例（其中男　１９例，女１３例），测定其Ｐｈｅ为６６．２±２０．５／２ｍｏｌ／　Ｉ　（范围为３Ｏ．５～１１３．０／２ｍｏｌ／Ｉ　）；Ｔｙｒ为５９．５±　１８．８／２ｍｏｌ／Ｌ（范围为２４．７～８５．８／２ｍｏｌ／Ｌ）；Ｐｈｅ／　Ｔｙｒ为１．１２士０．２４（范围为０．７３～１．６６）。要建立　起正常新生儿足跟血Ｐｈｅ，Ｔｙｒ及Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比值的　参考范围用于ＰＫＵ的筛查，有待于更多临床标本　及资料的收集。　３　讨论　ＰＫＵ是一种呈世界性分布的遗传代谢　性疾病，也是一种可通过早期筛查、诊治并取得良　好控制的疾病。ＰＫＵ的筛查方法迄今常用的有细　菌抑制法、荧光法与酶法等。Ｇｕｔｈｒｉｅ细菌抑制法　（ＢＩＡ）作为最早应用的ＰＫＵ筛查方法在我国现今　仍被人们广泛应用，该法操作简单，实验条件要求　不高，成本低。但该法只能进行半定量测定，耗时较　长，且受制板温度、琼脂板血片分布等众多因素的　影响，难于质控　］。ＢＩＡ在国际上使用的实验室越　来越少，在参加ＣＤＣ　Ｐｈｅ质控的近１　３００家实验　室中，２００５年上半年仍用该法的仅为４．９５　］。荧　光法是利用苯丙氨酸与茚三酮试剂反应产生荧光，　通过测定荧光强度来测算苯丙氨酸浓度，荧光法无　维普资讯 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现代检验医学杂志第２３卷第４期２００８年７月　Ｊ　Ｍｏｄ　Ｌａｂ　Ｍｅｄ，Ｖｏ１．２３，Ｎｏ．４，Ｊｕ１．２００８　２３　论从实验的精密度，还是准确性上都优于ＢＩＡ，具　研究。虽然其抗凝原理不同，但结果表明，二者对于　用该法测定Ｐｈｅ和Ｔｙｒ都是适用的。研究亦表明，　有更灵敏、准确、定量的特点［４］。该方法实现了从定　性到定量的飞跃，并可批量检测，亦可用于ＰＫＵ　的治疗监控。现常用的有Ｌａｂｓｙｓｔｅｍ试剂盒及　末梢血的Ｐｈｅ和Ｔｙｒ浓度与血浆有良好的相关　性。标本放置时间对测定结果的影响，以前的研究　都集中在对于干血滤纸片的研究上［８］，由于本研究　采用微量全血进行测定，故对其不同保存方式进行　了研究。根据一般标本周转所需要的时间，选择了　观察其在１　ｗ内的变化，结果显示，室温下２４　ｈ内　ｗａｌ１ａｃ试剂盒，在我国已部分取代了细菌抑制法。　但由于该反应为非特异性反应，且荧光试剂不够稳　定，尤其是荧光增强剂，只能每次检测前临时配置，　使得操作过程繁琐，单个样本测试时间在２　ｈ左　右，需要特殊的设备。　ＨＰＩ　Ｃ技术作为一种集分离和测定于一体的　分析技术，在ＰＫＵ的筛查和确证中发挥着极其重　要的作用，包括有离子交换色谱法、反相高效液相　色谱法、毛细管电泳色谱技术等。由于其分离的高　效能，不仅可以测定标本中Ｐｈｅ的浓度，而且可同　时测定Ｔｙｒ及Ｔｒｐ等芳香族氨基酸的浓度，因而　被认为是现今Ｐｈｅ测定的参考方法。Ｌｅｖｙ等在观　察了１　０００多例样本后发现Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比值能有效　的区别ＰＫＵ患者与非ＰＫＵ患者，当切割点为２．０　时，ＰＫＵ筛查的敏感性和特异性可达１００　，可避　免大量的重复测定［５］。同时，在ＰＫＵ患者用低Ｐｈｅ　饮食治疗时，Ｐｈｅ／Ｔｙｒ比率可用来评价患者的智力　行为功能　Ｊ。　虽然现在ＨＰＬＣ测定Ｐｈｅ的方法很多，但要　么标本用量大，要么用于血片采集标本检测时要进　行柱前或柱后衍生，操作复杂，试剂成本昂贵口］。因　而，现在的ＨＰＩ　Ｃ技术基本上只用于ＰＫＵ的确诊　和少量的治疗监控中。目前的报道，用直接法测定　血液中的Ｐｈｅ　和Ｔｙｒ都采用静脉血，用血浆或血　清作为测定标本。由于新生儿采取静脉血难度大，　有的甚至需从颈静脉采血，患儿家长很难接受这种　采血方式，限制了其在ＰＫＵ筛查和ＰＫＵ患儿监　控中的应用。我们尝试用末梢血直接作为测定标　本，对标本处理过程及实验条件进行了改进，用血　量只需４Ｏ　ｌ，达到了微量的要求。从研究可知，高　效液相色谱一紫外法直接测定末梢血液中的Ｐｈｅ　和Ｔｙｒ浓度是切实可行的。该方法的精密度，准确　性，回收率，抗干扰能力，线性范围等指标都达到了　应用的要求。整个测定过程从标本采集到报告结果　只需２０　ｍｉｎ左右，方法简便、快速，可完全满足临　床的需求。　采取全血标本可使用的抗凝剂有许多，如ＥＤ—　ＴＡ、肝素、枸橼酸盐、草酸盐等。由于枸橼酸盐抗凝　时所用的抗凝剂为液体，且用量较大，故抗凝时对　采血量要严格按比例控制，才能得出准确的结果，　这在采集新生儿标本时不易做到，故本文选用了在　临床上常用的ＥＤＴＡ—Ｋ　与肝素两种抗凝剂进行　测定完毕是十分必要的，即便是在４℃条件下，５　ｄ　内也应进行测定，否则会引起测定值的假性增高。　至于冰冻条件下，只保存了１　ｗ，其结果未见有意　义的变化，具体最长稳定期是多长，有待进一步的　观察。这就要求人们如果是从外实验室采集标本送　检，最好是能把标本放置在冰袋内进行运送。总之，　本方法的成功建立，有望使筛查与确诊一步到位，　达到早诊早治的目标，亦可广泛用于苯丙酮尿症的　治疗监测。　参考文献：　［１］顾学范，王治国．中国５８０万新生儿苯丙酮尿症和先　天性甲状腺功能减低症的筛查［Ｊ３．中华预防医学杂　志，２００４，３（３８）：９９—１０２．　［２］张军力，盂峻，史珉，等．细菌抑制法筛查苯丙酮　尿症的质量控制［Ｊ］．内蒙古医学院学报，２００２，２４　（３）：１９１—１９２．　［３　３　Ｂｅｌｌ　ＣＪ．Ｎｅｗｂｏｒｎ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｑｕａｌｉｔｙ　ａｓｓｕｒａｎｃｅ　ｐｒｏ—　ｇｒａｍ　ｓｕｍｍａｒｙ　ｒｅｐｏｒｔ：ｉｎｂｏｒｎ　ｅｒｒｏｒｓ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　［Ｊ３．ＣＤＣ，２００５，１６（１）：１２－１３．　［４３　田国力，许洪平，朱伟明，等．新生儿苯丙酮尿症两种　实验室筛查方法的质量评价ｒＪ］．检验医学，２００７，２２　（２）：１　７１—１　７３．　［５３　Ｌｅｖｙ　ＰＡ，Ｍｉｌｌｅｒ　ＪＢ，Ｓｈａｐｉｒａ　Ｅ．Ｔｈｅ　ａｄｖａｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｈ—　ｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ　ｔｏ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｒａｔｉｏ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅａｒｌｙ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｈｅｎｙｌｋｅｔｏｎｕｒｉａ［Ｊ］．ｃ　ｉｎ　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ，１９９８，２７０（２）：　１　７７—１８１．　Ｅ６３　Ｌｕｃｉａｎａ　Ｍ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ　Ｊ，Ｎｅｌｓｏｎ　ＣＡ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ　ｂｅ—　ｔｗｅｅｎ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ——ｔｏ——ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｒａｔｉｏｓ　ａｎｄ　ｐｅｒｆｏｒ—－　ｍａｎｃｅ　ｏｎ　ｔｅｓｔｓ　ｏｆ　ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｄｏ—　ｌｅｓｃｅｎｔｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｅａｒｌｙ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ　ｆｏｒ　ｐｈｅｎｙｌｋｅ—　ｔｏｎｕｒｉａ［Ｊ］．Ｃｈｉｌｄ　Ｄｅｖ，２００１，７２（６）：１６３７—１６５２．　［７］Ｔｃｈｅｒｋａｓ　ＹＶ，Ｋａｒｔｓｏｖａ　ＬＡ，Ｋｒａｓｎｏｖａ　ＩＮ．Ａｎａｌｙｓ　Ｊｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ｂｙ　ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｒｅｖｅｒｓｅｄ—　ｐｈａｓｅ　ｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｐｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｗｉｔｈ　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ３．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，２００１，　９ｌ３（１—２）：３０３—３０８．　Ｅ８３李明训，陈西贵，李文杰，等．新生儿筛查滤纸干血样　测定的影响因素探讨ＥＪ］．中华检验医学杂志，２００１，　２４（６）：３３９～３４１．　收稿日期：２００７—１２－１３　修回日期：２００７—１２－２７