乳制品中乳铁蛋白的测定

现代农业科技２０１３年第１６期　食品科学　ＩＬＩＮ品中乳铁蛋白的测定　章寅高磊郑隽楼飞韩奕奕何亚斌郑小平　（农业部食品质量监督检验测试中心（上海），上海市乳品质量监督检验站，上海２００４３６）　摘要采用高效液相色谱法建立了乳制品中乳铁蛋白测定的分析方法。试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，提取液经肝素亲和　柱净化后，采用反相高效液相色谱柱分离，以二极管阵列检测器于２８０ｎｍ处检测，采用外标法定量。结果表明：乳铁蛋白在１０．０一ｌ　０００．０ｕ咖Ｌ　范围内线性良好。添加回收率为７５％～ｌ１０％，相对标准偏差（ＲＳＤ）小于２０％。该方法具有灵敏度高、准确度高、重现性好的特点，适合检测　机构或乳品企业日常样品中乳铁蛋白的检测。　关键词ＩＬｉＡ蛋白；高效液相色谱法：肝素亲和柱　中图分类号ＴＳ２５２．７　文献标识码Ａ　文章编号１０ｏ７—５７３９（２０１３）１６—０２９１—０２　．　乳铁蛋白是近年来国内外开发研究速度最快的一种营　的酸性多糖，有文献报道乳铁蛋白可与这类多负电荷分子　养添加剂，由于其具有广谱抗菌、抗病毒感染、调节体内铁　糖胺多糖结合。故在该文中采用ＨｉＴｒａｐＴＭ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰ（１　ｍＬ）　平衡、调解骨髓细胞的生成、抑制人体肿瘤细胞、同多种抗　肝素亲和柱作为目标化合物纯化和浓缩的前处理步骤。通　生素及抗真菌制剂协同有效治疗疾病等功效，使其产品在　过经过和未经过肝素亲和柱纯化的样品比较图．分析其对　国内外乳制品加工中的应用范围日益广泛【１－３ｌ。我国《食品　乳铁蛋白检测应用的可行性［７＝ｌ。　营养强化剂使用标准（ＧＢ１４８８０—２０１２）》中规定婴幼儿配方　１．３液相色谱条件　食品中乳铁蛋白的最大允许使用量为１．０　ｇ，ｋｇ，而目前国内　色谱柱：Ｃ４，５　ｍ，３００Ａ（孔径），２５０　ｍｍＸ４．６　ａｒｉｎ（内径）；　外未建立与乳制品中乳铁蛋白测定相关的国家标准。为保　检测波长：２８０　ｎｍ；柱温：３Ｏ℃；进样体积：５０　Ｌ；流速：１．０　证乳铁蛋白的安全生产和使用，该文建立了乳制品中乳铁　ｍＬ／ｍｉｎ；流动相：０．１％三氟乙酸溶液和乙腈，梯度洗脱参数　蛋白的检测方法，最大限度地保证市场中乳铁蛋白添加型　如表１所示。　产品的安全和质量水平，以保证乳制品安全，促进行业健康　表１流动相梯度洗脱程序　发展［４１。　１材料与方法　１．１供试材料、试剂与仪器　１－１．１供试材料。供试材料为婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方　米粉、成人配方奶粉。　１．４样品前处理　１．１．２试剂与仪器。Ａ￣ｌｅｎｔ　１２００高效液相色谱仪，配有二极　１．４．１提取。准确称取１　ｇ试样（试样中含乳铁蛋白０．１　管阵列检测器。肝素亲和柱（美国通用医药有限公司）。乙腈　１０．０　ｍｇ）于５０　ｍＬ烧杯中，加入５　ｍＬ温热的磷酸氢二钠溶　（色谱纯，美国Ｓｉｇｍａ公司产品），无水乙醇、氯化钠、磷酸、磷　液（温度不超过５０℃），搅拌使样品完全溶解，将样品全部　酸氢二钠、三氟乙酸（分析级，国药集团化学试剂有限公司　转入５０　ｍＬ具塞塑料离心管中，再向原烧杯中加入５　ｍＬ磷　产品）。超纯水Ｎａｎｏｐｕｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ（赛默飞世尔科技有限　酸氢二钠溶液，合并２次液体。漩涡振荡器振荡２ｒａｉｎ，于室　公司）。离心机ＪｏｕａｎＣｅｔｅｆｉｆｕｇｅＭＲ２３ｉ（赛默飞世尔科技有限　温下３　０００　ｒ／ａｒｉｎ离心１０　ａｒｉｎ。将上层脂肪层和下层沉淀层　公司）。　之间的液体小心转移到另一个５０　ｍＬ离心管中，再向原离　１．２试验方法　心管中加入５　ｍＬ磷酸氢二钠溶液重复操作１次．合并２次　１．２．１提取试剂的选择。在相同试验条件下分别以水和磷　液体作为样品提取液备用。　酸缓冲液作为提取试剂。测定样品加标回收率。比较水和磷　１．４．２净化。肝素亲和层析柱先用５　ｍＬ磷酸氢二钠溶液平　酸缓冲液对样品中乳铁蛋白的提取效果。　衡，处理完毕后加入样品提取液，待样品液体完全流出后，　１．２．２提取温度的选择。乳铁蛋白分子量为８０　ｋＤａ，是具有　再用１０　ｍＬ磷酸氢二钠溶液淋洗，弃去全部流出液。最后用　大约７００个氨基酸残基序列的单体糖蛋白，并连接１～２个　３　ｍＬ磷酸氢二钠一氯化钠溶液洗脱，收集全部流出液，用磷　配糖体。对于这一类大分子量的蛋白质，提取溶剂温度过高　酸氢二钠一氯化钠溶液定容至３　ｍＬ。将收集溶液过０．４５　ｍ　会造成乳铁蛋白结构的变化，致使检测结果偏离实际值。　水相滤膜，供液相色谱一ＤＡＤ检测分析用。　研究分别选取２５、５０、６０、７０、８０、９０℃进行比较。准确吸取　２结果与分析　１　ｍＬ　２００￣ｇ／ｍＬ的标准溶液于ＥＰ管中，分别于２５、５０、６０、　２．１提取试剂的选择　７０、８０、９０℃下恒温水浴１　ｈ，上机测定［５－ｏｑ。　试验证明，在同样的试验条件下用磷酸缓冲液作为提　１．２．３肝素亲和柱的选择。肝素（Ｈｅｐａｒｉｎ）是一种含硫酸酯　取试剂的回收率比水作为提取试剂高５０％。另外，样品中含　作者简介章寅（１９８６一），女，浙江上虞人．助理工程师。研究方向：食　有比较高浓度的蛋白类物质时．乳铁蛋白在磷酸盐缓冲液中　品安全与检测。　通讯作者　的溶解度优于水中；后续试验采用肝素亲和的活化需要磷　收稿日期２０１３—０７—０８　酸盐缓冲液；采用缓冲液作为提取试剂可以保证样品上柱　２９ｌ　食品科学　现代农业科技２０１３年第１６期　前的ｐＨ值在试验要求范围。　表３乳铁蛋白标准溶液与峰面积响应值之间的　２．２提取温度的选择　线性关系　试验数据表明，随着温度的上升，乳铁蛋白的结构发生　标样浓度∥￣ｇ／ｍＬ　峰面积　标样浓度∥ｔＬｇ／ｍＬ　峰面积　１０　２４．２４　２５０　６４１．９Ｏ　了变化。从表２可知，目标峰的峰高由２５℃的７６．９降低至　２５　３６．８９　５ｏｏ　１　３０６．０　９０℃的２２．２。因此得出结论，为了保证试验结果的准确性，　５Ｏ　８８．５３　ｌ　０ｏｏ　２　５０１．０　１００　２２４．７０　在乳铁蛋白提取过程中必须控制提取缓冲液的温度在５０　２９００　ｏｃ以下。　表２温度对乳铁蛋白提取的影响　２　３００　嚣１　７００　母　１　１０ｏ　５ｏｏ　一１ｏｏ　０　２００　４００　６００　８００　ｌ　０００　ｌ　２ｏｏ　标样浓度∥　ｇ，ｍＬ　图２乳铁蛋白标准溶液与峰面积响应值之间的线性关系　０．９９９　１，回归方程分别为ｙ＝２．５４０　７ｘ一１３．２７５。　根据限量检测要求．对婴幼儿配方奶粉、婴幼儿配方米　粉、成人配方奶粉等几类样品中乳铁蛋白进行了加标回收　重复试验。根据信噪比Ｓ／Ｎ＝３，试验结果表明，该方法检出限　均达到２０ｍｓ／１００ｇ。　２．５回收率的测定　应用该方法，添加标准物质，对婴幼儿配方奶粉、婴幼　…．．　儿配方米粉、成人配方奶粉３类样品中进行乳铁蛋白回收　率的测定，从表４可知，按已确定的样品提取条件和色谱条　件测定添加回收量，试验表明平均回收率达到７５％～１００％，　相对标准偏差＜１５％，说明该方法对不同样品中、不同含量　的乳铁蛋白的测定均有较好的准确度。　３结论与讨论　采用高效液相色谱法（ＨＰＬＣ）的方法测定乳制品中乳　铁蛋白含量的测定。试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提　表４不同样品中添加乳铁蛋白回收率试验结果　取，提取液经ＨｉＴｒａｐＴＭ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰ柱或相当者净化浓缩后，　ｉｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　ｔｙｐｅ　１　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｔ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　１９９８，３０（９）：　用反相高效液相色谱柱分离，于紫外检测器２８０　ｎｍ处检　１０５５—１Ｏ６３．　【３】ＶＯＲＬＡＮＤ　Ｌ　Ｈ．Ｌａｅｔｏｆｅｒｒｉｎ：ａ　ｍｕｈｉｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ　ｇｌｙｃｏｐｍｔｅｉｎ．ＡＰＭＩＳ．１９９９，　测，外标法定量。该方法与文献中报道的方法相比，具有操　１０７（７－１２）：９７１－９８１．　作方便简单、耗时较短、重复性好、回收率高、灵敏度高的　『４１　ＺＨＡＮＧ　Ｇ　Ｈ，ＭＡＮＮ　Ｄ　Ｍ，髑ＡＩ　Ｃ　Ｍ．Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　优势。　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｂｙ　ａ　ｈｕｍａｎ　ｌａｅｔｏｆｅｒｒｉｎ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅⅢ．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｌｎｌｎｕｎ，　１９９９，６７（３）：１３５３－１３５８．　４参考文献　［５】徐峥奎．乳铁蛋白的开发现状与前景叨．中国保健食品，２０１３（４）：１６－１７．　【ｌ】ＬＥＶＡＹ　Ｐ　Ｆ，ＶＩＬＩＯＥＮ　Ｍ．Ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ：ａ　ｇｅｎｅｒａｌ　ｒｅｖｉｅｗ［Ｊ］．Ｈａｅｍｔｄｏ￣ｃａ，　【６１赵红宇，刘晓飞，周盛华，等．牛初乳中乳铁蛋白的分离纯化【Ｊ】．农产　１９９５，８０（３）：２５２—２６７．　品加工・学刊（下），２０１３（５）：３—５．　［２１ＰＵＤＤＵＰ．ＢＯＲＧＨＩＰ，ＧＥＳＳＡＮＩ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ａｎｔｉｖｉｒｌａ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆｂｏｖｉｎｅｌａｃｔｏ—　【７】孙晶，张昊，郭慧媛，等．乳铁蛋白抑菌功能的研究进展【Ｊ］．中国乳业，　ｆｅｒｒｉｎ　ｓａｔｕｒａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔａｌ　ｉｏｎｓ　Ｏｎ　ｅａｒｌｙ　ｓｔｅｐｓ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆ一　２０１２（１０）：３８—４１．　２９２