1、革兰氏染色:
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色
步骤：
（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。
（2）晾干：与简单染色法相同。
（3）固定，与简单染色法相同
（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。
（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。
（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。
（7）水洗：用水洗去碘液。
（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染5min。
（10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。
（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（13）实验完毕后的处理：
①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。
②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
2、氧化酶（Oxidase）试验
氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞
色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。
试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。
注意事项：
（1） 盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化，溶液应装在棕色瓶中，并在冰箱内保存，如溶液变为红褐色，即不宜使用。
（2） 铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒（或牙签）来挑取菌苔。
（3） 在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜，如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触，从而延长了反应时间，造成假阴性。
3 、靛基质（Imdole）试验
某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。
试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36±1C培养24h时后，取约2ml培养液，加入Kovacs氏试剂2~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。
实验证明靛基质试剂可与17种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。
4、甲基红（Methyl Red）试验
肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。
试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于MR－VP生化鉴定管，于36通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果。
甲基红为酸性指示剂，pH范围为4.4~6.0，其pK值为5.0。故在pH5.0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。
5、V-P试验
某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。
试验方法：
１）O’Meara氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养48h，培养液1ml加O’Meara试剂（加有0.3%肌酸Creatine或肌酸酐Creatinine的40%氢氧化钠水溶液）1ml，摇动试管1~2min，静置于室温或36±1°C恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有主张在48~50°C水浴放置2h后判定结果者。
２）Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36±1°C培养4天、培养液2.5ml先加入5°Cα萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液0.6ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36±1°C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。
３）快速法：将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5%α-萘酚3滴，40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用。
本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。
6. 柠檬酸盐或丙酸盐的利用
某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为碳源，及磷酸胺作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则培养基中由于有游离钠离子存在而呈碱性。
接种与观察结果：取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养3－7天，培养基呈碱性（蓝
色）者为阳性反应，不变者则为阴性。
7.硫化氢（H2S）试验
有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。
试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36±1℃培养24~28h，培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度；用管塞压住置36±1℃培养1~6天。纸条变黑为阳性。
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8、利用丙二酸盐试验
丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。
许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。
接种和观察结果：
用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1－2d，观察培养基变色情况。
如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。
9、氨基酸脱羧酶的测定
有些细菌含有氨基酸脱羧酶，使羧基释出，生成胺类和二氧化碳。此反应在偏酸的条件下进行。当培养基含胺类时呈碱性反应，使指示剂变色。
接种与观察结果：用幼龄培养液作为菌种，直接接种。接种后封油，对照管与测定管同时接种封油。肠肝菌科的细菌于37℃培养4天观察。当指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。对照管应呈黄色反应。
10、硫化氢-靛基质-动力（SIM）琼脂试验
试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36±1℃培养18~24h，观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10min，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。
本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。
11、明胶（Gelatin）液化试验
有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。
试验方法：挑取18~24h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20~22℃培养7~14天。明胶高层亦可培养于36±1℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性，10~20min后，菌落周围应出现清晰带环。否则为阴性。
12、氰化钾试验
氰化钾（KCN）是呼吸链末端抑制剂。能否在含有氰化钾的培养基中生长，是鉴别肠杆菌科各属常用的特征之一。
接种和观察结果：
用幼龄菌种接种于加氰化钾的测定培养基和未加氰化钾的空白培养基中，适温培养1－2d，观察生长情况。
能在测定培养基上生长者，表示氰化钾对测定菌无毒害作用，为阳性。若在测定培养基和空白培养基上均不生长，表示空白培养基的营养成分不适于测定菌的生长，必须选用其它合适的培养基。而测定菌在空白培养基上能生长，在含氰化钾的测定培养基上不生长，为阴性结果。
应该注意：氰化钾是剧毒药品，操作时必须小心。培养基用毕，每管加几粒硫酸亚铁和0.5mL20％KOH以解毒，然后清洗。
13、利用丙二酸盐试验
丙二酸盐是三羧酸循环中琥珀酸脱氢酶的抑制剂。能否利用丙二酸盐，也是细菌鉴定中的一个鉴别性特征。
许多微生物代谢有三羧酸循环，而琥珀酸脱氢是三羧酸循环的一个环节，丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶，与丙二酸不被分解，所以琥珀酸脱氢酶被占据，不能释放出来催化琥珀酸脱氢反应，抑制了三羧酸循环。
接种和观察结果：
用幼龄菌种接种测定培养基和空白培养基，于适温培养1－2d，观察培养基变色情况。
如测定培养基生长并变蓝色，表示可利用丙二酸盐，为阳性结果。反之，如测定培养基未变色，而空白对照培养基生长，则为阴性，即不利用丙二酸盐。
14、葡萄糖的氧化发酵试验
在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是1项重要依据。细菌对糖类的利用有2种类型：1种是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另一种则以分子氧作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。为此，Hugh和Leifson提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵型产酸。这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一基础培养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。
（1）接种 ：以18－24h的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接4管，其
中2管用油封盖（凡士林：液体石蜡＝1：1混合后灭菌），约加0.5－1厘米厚，以隔绝空气为闭管。另2管不封油为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养1、2、4、7天观察结果。
（2）结果观察：氧化型产酸――仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱（1－2d），后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱内产生气泡。
15、糖或醇类发酵试验
不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。
试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36±1.0°C培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力、培养物可呈弥散生长。
本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。
注：对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在36℃18－24h即可出结果。
16、葡萄糖酸盐的氧化
假单胞菌属和肠道杆菌科的细菌，可氧化葡萄糖酸为2－酮基葡萄糖酸。葡萄糖酸无还原性基团，氧化后形成酮基，则可将斐林氏试剂的呈蓝色的铜盐还原为砖红色的Cu2O沉淀。
试验方法：用pH7.2的磷酸缓冲液配制成含1％葡萄糖酸盐（可用葡萄糖酸钠或葡萄糖酸钙）的溶液。分装试管，每管2mL。刮取适温培养18－24小时的菌苔至2mL的葡萄糖酸盐溶液中制成浓的菌悬液，置30℃过夜，然后每管加入0.5mL的斐林试剂，放在沸水浴中加热10分钟，试管中液体由蓝色变为黄绿，绿橙色或出现红色沉淀者为阳性反应，如溶液不变色者为阴性。
17、β-半乳糖苷酶（ONPG）的测定
本试验应用于肠肝菌科的鉴定。
测定步骤：
（1） 将测定菌接种于TSI斜面上，培养于37℃18h（或其他最适温度）
（2） 挑取1大环菌苔入约0.25mL的生理盐水中制成菌悬液，每管加1滴甲苯，摇匀（有助于酶的释放），于37℃放置5分钟。
（3） 在菌悬液中加入0.25mL的0.75mol/L ONPG，测定管置于37℃水浴培养。经30分、1、2、3、……24h进行观察，如有黄色者则为阳性。
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