一、目的要求
1、掌握比色法检查阿司匹林片剂中游离水杨酸的实验原理。 2、掌握两步滴定法测定阿司匹林片剂含量的实验原理。 3、掌握水杨酸类药物的鉴别、检查与含量测定的操作方法。
二、基本原理
（一）鉴别（三氯化铁反应）
阿司匹林为水杨酸酯类药物，加热水解后产生水杨酸，水杨酸及其盐在中性或弱酸性条件下（适宜pH为4.0~6.0），会与三氯化铁试液反应，生成紫堇色的铁配位化合物。 （二）检查——游离水杨酸（对照法）
阿司匹林生产过程中乙酰化不完全或贮存过程中水解产生的水杨酸对人体有毒性，而且分子中酚羟基在空气中被逐渐氧化成一系列醌型有色物质，使阿司匹林成品变色，因而需加控制。
阿司匹林为水杨酸酯，无游离酚羟基，不能直接与高铁盐作用，而其杂质游离水杨酸含酚羟基，可与高铁盐反应显紫堇色，因此，将适量阿司匹林供试品溶液与一定量水杨酸对照品溶液生成的色泽对比，即可控制阿司匹林中游离水杨酸的含量。该法灵敏，可检测出1 µg的游离水杨酸。
（三）含量测定——两步滴定法
阿司匹林分子结构中含有酯键，易水解成水杨酸和醋酸，片剂中为防止酯键水解加入少量酒石酸或枸橼酸做稳定剂，因此在片剂中有酸性杂质，含量测定时为消除酸性杂质干扰，采用两步滴定法。
第一步 中和，消除酸性杂质（酸性附加剂和降解产物）的干扰
阿司匹林：
水杨酸： 醋酸：
枸橼酸：
第二步 水解后剩余滴定
（定量过量）
（剩余）
三、仪器及试药
电热恒温干燥箱，万分之一分析天平，托盘天平（精度0.01 g），称量瓶，称量纸，药匙，量筒（10 mL、50 mL、100 mL），电炉，研钵，烧杯（25 mL），胶头滴管，容量瓶（100 mL），玻璃漏斗，滤纸，纳氏比色管（50 mL），锥形瓶（250 mL），酸滴定管，碱式滴定管，水浴锅，温度计，阿司匹林肠溶片，纯化水，乙醇（分析纯），水杨酸（分析纯），酒石酸（分析纯），中性乙醇（分析纯），三氯化铁（分析纯），盐酸（分析纯），硫酸铁铵（分析纯），酚酞（分析纯），氢氧化钠（分析纯)，邻苯二甲酸氢钾（基准试剂），硫酸（分析纯），无水碳酸钠（基准试剂），甲基红（分析纯），溴甲酚绿（分析纯）
四、实验内容与方法
（一）鉴别（三氯化铁反应）
取本品的细粉适量（约相当于阿司匹林0.1 g），加水10 mL，煮沸，放冷，加三氯化铁试液1滴，即显紫堇色。 （二）检查——游离水杨酸
取本品5片，研细，用乙醇30 mL分次研磨，并移入100 mL容量瓶中，充分振摇，用水稀释至刻度，摇匀，立即滤过，精密量取滤液6 mL，置50 mL纳氏比色管中，用水稀释至50 mL，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液3 mL，摇匀，30秒内如显色，与对照液（精密量取0.01%水杨酸溶液4.5 mL，加乙醇3 mL，0.05％酒石酸溶液1 mL，用水稀释至50 mL，再加上述新制的稀硫酸铁铵溶液3 mL，摇匀）比较，不得更深。（限量1.5%） （三）含量测定——两步滴定法
取本品30片，研细，用中性乙醇70 mL分数次研磨，并移入100 mL容量瓶中，充分振摇，再用水适量洗涤研钵数次，洗液合并于100 mL容量瓶中，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取滤液10 mL（约相当于阿司匹林0.3g），置锥形瓶中，加中性乙醇20 mL，
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振摇，使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3滴，滴加氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）至溶液显粉红色，再精密加氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）40 mL。置水浴上加热15分钟并时时振摇，迅速放冷至室温，用硫酸滴定液（0.05 mol／L）滴定，并将滴定结果用空白实验校正。每l mL氢氧化钠滴定液（0.1 mol／L）相当于18.02 mg的C9H804。
中国药典（2005）规定，本品含阿司匹林(C9H804)应为标示量的95.0％～105.0％。 阿司匹林片剂含量计算公式：
标示量（%）=
式中，V0为空白试验时消耗硫酸滴定液的体积（mL）；V为样品测定时消耗硫酸滴定液的体积（ml）；F为硫酸滴定液的浓度校正因数；T为滴定度（即18.02 mg）；m为供试品片粉的取样量（g）；W为供试品的平均片重（g）；标示量即片剂的规格量。
五、注意事项
1、中和滴定速度稍快，避免阿司匹林在碱中水解；注意旋摇，防止局部过浓。 2、第一步中和时以溶液出现粉红色30秒不退即可，消耗的氢氧化钠不必计量。
3、加碱、加热水解阿司匹林应不时振摇，保证水解完全；然后迅速放冷，尽量避免碱液在受热时吸收二氧化碳。
六、思考题
1、在本实验中，中性乙醇对什么指示液显中性？ 2、特殊杂质水杨酸的限量是多少？
3、为什么阿司匹林制剂不可以用直接滴定法来测定其含量？ 4、阿司匹林两步滴定法为什么要做空白实验，目的是要消除什么？ 附：实验准备
1、 三氯化铁试液：取三氯化铁9 g，加水使溶解成100 mL，即得。
2、 新制的稀硫酸铁铵溶液：取1 mol/L盐酸溶液1 mL，加硫酸铁铵指示液2 mL后再加水适量使成100 mL。
3、 1 mol/L盐酸溶液：取盐酸90 mL，加水适量使成1000 mL，摇匀。 4、 硫酸铁铵指示液：取硫酸铁铵8 g，加水100 mL使溶解，即得。 5、 0.01％水杨酸溶液：取水杨酸0.01 g加水100 mL溶解即得。 6、 0.05%酒石酸溶液：取酒石酸0.05 g加水100 mL溶解即得。 7、 酚酞指示液：取酚酞1 g，加乙醇100 mL使溶解，即得。
8、 中性乙醇：取95%乙醇100 mL于烧杯中，加入1～2滴酚酞指示液，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液滴定至微红色，即得。
9、 0.1 mol/L氢氧化钠滴定液：取澄清的氢氧化钠饱和溶液5.6 mL，加新沸过的冷水使成
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1000 mL，摇匀。
10、氢氧化钠饱和溶液：取氢氧化钠适量，加水振摇使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄清后备用。
11、0.1 mol/L氢氧化钠滴定液的标定：取在105 oC干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约0.6 g，精密称定，加新沸过的冷水50 mL，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示液2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每1 mL氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于20.42 mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度，即得。
12、0.05 mol/L硫酸滴定液：取硫酸3.0 mL，缓缓注入适量水中，冷却至室温，加水稀释至1000 mL，摇匀。
13、0.05 mol/L硫酸滴定液的标定：取在270 oC~300 oC干燥至恒重的基准无水碳酸钠约0.15 g，精密称定，加水50 mL使溶解，加甲基红－溴甲酚绿混合指示液10滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为紫红色时，煮沸2分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每1 mL硫酸滴定液（0.05 mol/L）相当于5.30 mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度，即得。
14、甲基红－溴甲酚绿混合指示液：取0.1%甲基红的乙醇溶液20 mL，加0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液30 mL，摇匀，即得。
15、0.1%甲基红的乙醇溶液：取甲基红0.1 g，加乙醇使溶解成100 mL，即得。 16、0.2%溴甲酚绿的乙醇溶液：取溴甲酚绿0.2 g，加乙醇使溶解成100 mL，即得。
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实验二 维生素AD滴剂中维生素A的鉴别与含量测定
一、目的要求
1、掌握维生素A鉴别反应的实验原理；
2、掌握三点校正法测定维生素A含量的原理和操作方法；（三点校正法即紫外-可见分光光度法）
3、掌握三点校正法的计算方法；
4、掌握胶囊型滴剂的含量测定处理及其计算方法。
二、实验原理
维生素A的结构为一个具有共轭多烯醇侧链的环己烷，能与氯仿、乙醚、环己烷或石油醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶，由于其中有多个不饱和键，性质不稳定，易被空气中氧或氧化剂氧化，易被紫外光裂解，并且其对酸不稳定。其醋酸酯比维生素A稳定，临床使用一般将本品或棕榈酸酯溶于植物油中应用。因此，维生素A及其制剂除需密封在凉暗处保存外，还需充氮或加入合适的抗氧剂。 1、鉴别反应
维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中即显蓝色，渐变紫红色。反应机理为维生素A与三氯化锑中存在的亲电试剂氯化高锑反应，生成不稳定的蓝色碳正离子。 2、含量测定
维生素A具有紫外吸收特征，在325 nm~328 nm的范围内有最大吸收；但由于维生素A制剂中含有稀释用油，且维生素A原料药中混有其他杂质，因此测得吸光度中含有无关吸收引入的误差，需用校正公式法校正以得到正确结果。本实验采用三点校正法。
三点校正法是在三个波长处测得吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量，故本法称为“三点校正法”。该原理主要基于（1）杂质的无关吸收在310 nm～340 nm的波长范围内几乎呈一条直线，且随波长的增长吸收度下降。（2）物质对光吸收呈加和性的原理。即在某一样品的吸收曲线上，各波长处的吸收度是维生素A与杂质吸收度的代数和，因而吸收曲线也是二者的叠加。
三点波长的选择采用等波长差法，即在λ1的左右各选一点为λ2和λ3，使λ3-λ1=λ1-λ2。中国药典规定λ1=328 nm，λ2=316 nm，λ3=340 nm。
三、仪器及试药
（一） 器材
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紫外-可见分光光度仪，比色皿，万分之一天平，托盘天平（精度0.01g），称量纸，量筒（100 mL），胶头滴管，刻度吸管（1 mL），容量瓶（100 mL），烧杯若干个，剪刀、镊子 （二） 试药
维生素AD滴剂，纯化水，三氯甲烷（分析纯，无水乙醇），三氯化锑（分析纯），环己烷（分析纯），乙醚（分析纯）
四、实验内容及步骤
1、鉴别
25%三氯化锑的三氯甲烷溶液的配制：取三氯化锑25 g，加三氯甲烷使溶解成100 mL。 取维生素AD滴剂，加三氯甲烷稀释成每1 mL含维生素A 10~20 U的溶液；取1 mL，加25%三氯化锑的三氯甲烷溶液2 mL，观察实验现象。 2、含量测定
（1）胶丸内容物平均重量的测定
取本品数粒，精密称定，倾出内容物，混合均匀。囊壳用乙醚洗净，置通风处使溶剂自然挥尽，再精密称定囊壳质量，求得内容物的装量。 （2）供试品溶液的制备与测定
取内容物适量精密称定，置100 mL容量瓶中，用环己烷溶解并稀释到每1 mL含维生素A 9~15 U的溶液。照紫外-可见分光光度法，扫描400~250 nm波长范围内维生素AD滴剂的吸光度，并选点测定300 nm、316 nm、328 nm、340 nm、360 nm处的吸光度。 （1）如果最大吸收峰波长在326~329nm之间，且所测得各波长吸光度比值不超过表中规定的±0.02，
则不用校正公式计算吸收度，而直接用328 nm处测得的吸收度A328求得。
（2）如果最大吸收峰波长在326~329nm之间，但所测得的各波长吸光度比值超过表中规定值的±0.02，应按下式求出校正后的吸光度，然后再计算含量：
A328（校正）=3.52(2A328-A316-A340)
（3）如果在328nm处的校正吸光度与未校正吸光度相差不超过±3.0%，则不用校正吸光度，仍以未经校正的吸光度计算含量。
（4）如果校正吸光度与未校正吸光度相差在-15%至-3%之间，则以校正吸光度计算含量。 （5）如果校正吸光度超出未校正吸光度的-15%至-3%的范围，或者吸收峰波长不在326~329nm之间，则供试品须按下述第二法（皂化法）测定。（本次实验不做）
中国药典（2005）规定，本品含维生素A应为标示量的90.0%~120.0%。
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五、数据记录及处理
1、各波长吸收度与波长328 nm处吸收度的比值。
波长（nm）
300 316 328 340 360
测得吸光度
A1 A2 A3 A4 A5
吸光度比值
药典规定值 0.555 0.907 1.000 0.811 0.299
计算值 A1/A3 A2/A3 A3/A3 A4/A3 A5/A3
两个比值的 差值
2、求E1%1cm：（E1%1cm表示当溶液浓度为1%（g/mL），液层厚度为1cm时的吸收度数值）
由 A=E1%1cm×C×L，求得E1%1cm =A /（C×L）=A×D/（W×L×100）。
A：328 nm处直接测得的吸光度或校正后的吸光度 C：以供试品为纯品而计算得到的供试品浓度，g/100 mL L：光程长，1 cm W：供试品的重量，g；
D：供试品的稀释倍数（本实验D=100）。
3、求效价（IU/g）：效价指每克供试品中所含维生素A的国际单位数（IU/g）。
计算公式IU/g =E1%1cm×CF
CF：换算因数，维生素A醇，1830；维生素A醋酸酯，1900
4、求标示量（%）
标示量（%）=（E1%1cm×1900×W×100%）/标示量
——
——
W ：胶丸平均内容物重量，g；
标示量：供试品标签上注明的每克或每胶丸含有的维生素A的国际单位数。
六、注意事项
1、维生素A遇光易氧化变质，故测定应在半暗室中尽快进行。
2、剪胶丸所用的剪刀用前应用乙醚洗净，剪刀上黏附的内容物用乙醚洗入容器中。 3、三点校正法测定时，除其中一点在最大吸收波长测定外，其余两点均在最大吸收的两侧上升或下降陡部的波长处进行，若仪器波长不够准确时，即会带入较大误差，故测定前应对所用仪器进行波长校正。 4、鉴别反应时所有仪器均需干燥。 5、为防止污染环境，环己烷应回收。
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七、思考题
1、为何不直接以紫外-可见分光光度法测定维生素A的含量，而要采用较为繁琐的三点校正法？用于测定的三点该如何选择？ 2、计算式中的参数1900是如何得来的？ 3、鉴别实验时为什么要求在无水条件下进行？
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