一、蔗糖酶的制备 1、提取
称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。（取出3ml于冰箱中保存）
2、热处理
（1） 盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离
心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。 （3）上清液即为热级分Ⅱ。（取出3ml于冰箱中保存）
3、乙醇沉淀
将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。然后4℃，1000r/min离心10min。倾去上清，并滴干。将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化
将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。及洗脱峰图如下：
离子交换吸附梯度洗脱曲线200150A2801005000102030405060洗脱份数708090
三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定 （一）还原糖含量测定 1、各级分稀释倍数的确定
级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍） 级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）
级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍） 取20μl稀释至2ml（100倍）
酶液(ml) H2O(ml) PH5.0乙酸(ml) 蔗糖(0.2M)(ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 60℃反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应，然后加2 mlDNS沸水浴5 min。 之后流水冷却，并定容到25 ml，测定A540。 吸光度 0.220 0.138 0.084 0.218 0.114 0.056 0.184 0.077 0.037 0.012 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.6 0.0 级分Ⅰ 0.3 0.3 0.2 0.4 0.6 0.0 级分Ⅱ 0.6(1000.3 0.3 0.2 0.4 倍) 0.0 级分Ⅲ 0.6(300倍) 0.0 0.3(300倍) 0.3 0.2(300倍) 0.4 由以上数据可知，在测定各级分还原糖含量时，级分Ⅰ和级分Ⅱ稀释30倍，级分Ⅲ稀释100倍。
2、生成还原糖的大批量测定 管号 酶液(ml) H2O(ml) PH5.0乙酸 Glu(4mM) 0.4MNaOH 蔗糖(0.2M) 1 0.6 / 0.2 / 1 0.2 2 / 0.6 0.2 / / 0.2 3 0.6 / 0.2 / / 0.2 级分Ⅰ 4 0.6 / 0.2 / / 0.2 5 0.6 / 0.2 / / 0.2 6 0.6 / 0.2 / / 0.2 级分Ⅱ 7 0.6 / 0.2 / / 0.2 8 0.6 / 0.2 / / 0.2 9 0.6 / 0.2 / / 0.2 级分Ⅲ 10 11 12 13 / 0.6 0.6 / / / 1 0.8 / 0.2 0.2 / / / / / / 0.2 / / / 0.2 0.2 / ６０℃反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应，然后加2 mlDNS沸水浴5 min。 之后流水冷却，并定容到25 ml，测定A540。 吸光度 处理后的吸光度 对应的Glu含量（μmol） E' 平均E' Units/ml(原始组分) 0.001 -0.007 0.322 0.332 0.324 0.185 0.186 0.185 0.145（舍去） 0.192 0.188 0.05 0.306 0.316 0.308 0.169 0.17 0.169 9.11 9.40 9.17 5.03 5.06 5.03 45.5 47.0 45.8 25.1 25.3 25.1 46.1 25.2 0.176 0.172 5.24 5.12 87.3 85.3 86.3 0.0004335 0.0007937 0.0002317 在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml） Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数
由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋白）。由此对第二个和第三个峰进行活力测定。 管号 酶液(ml) H2O(ml) PH5.0乙酸 蔗糖(0.2M) 1 / 1.0 / / 第二个峰 2 0.6 / 0.2 0.2 3 0.6 / 0.2 0.2 第三个峰 4 0.6 / 0.2 0.2 5 0.6 / 0.2 0.2 60℃反应10min，再加1 ml 0.4 M NaOH终止反应， 然后加2 mlDNS沸水浴5 min。之后流水冷却， 并定容到25 ml，测定A540。 吸光度 Glu含量（μmol） E' 平均E' Units/ml(原始组分) -0.011 / / -0.012 / / 0.013 0.387 0.012 0.357 0.06448 0.05952 0.06200 0.04032 备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定 1、各级分稀释倍数的确定 1、标准曲线的制作 管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 蛋白标准液（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.8 1.0 H2O(ml) 考马斯亮蓝(ml) 蛋白质含量(μg) A595 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 5 0 0 5 20 5 40 5 60 5 80 0.5 5 100 0.4 0.2 0.0 5 120 5 160 5 200 0.093 0.164 0.322 0.414 0.460 0.588 0.736 0.948 蛋白质标准曲线10.8吸光度y = 0.0048xR2 = 0.99430.60.40.20050100150蛋白质含量（μg）200250
2、各级分稀释倍数的确定 级分Ⅰ 级分Ⅱ 8 12 稀释倍数 4 8 12 4 蛋白溶液（ml） 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 H2O(ml) 考马斯亮蓝(ml) 吸光度 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 5 5 5 5 5 5 级分Ⅲ 10 0.2 0.8 5 20 0.2 0.8 5 30 0.2 0.8 5 0.162 0.103 0.134 0.216 0.086 0.169 0.155 0.092 0.124 由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
2、蛋白质含量的大批量测定
蛋白溶液（ml） H2O(ml) 考马斯亮蓝(ml) A595（1） A595（2） A595（3） 平均A595 蛋白质含量（μg） 蛋白质浓度(mg/ml) 级分Ⅰ 0.05 0.95 5 0.300 0.326 0.370 0.332 69.17 1.383 级分Ⅱ 0.05 0.95 5 0.209 0.215 0.249 0.224 46.74 0.9347 级分Ⅲ 0.05 0.95 5 0.089 0.083 / 0.086 17.92 1.792 峰Ⅰ 0.05 0.95 5 0.048 0.048 / 0.048 10.00 0.2000 峰Ⅱ 0.05 0.95 5 0.075 0.089 0.081 0.082 17.01 0.3403 （三）酶的纯化表 级分 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 记录体积（ml） 50 53 50 5 蛋白质（mg/ml） 1.383 0.9347 1.792 0.3403 总蛋白（mg） 69.15 49.5391 89.6 1.7015 Units（ml） 0.0004335 0.0007937 0.000232 0.04032 总Units 1.084 2.103 1.931 0.3360 比活（Units/mg） 0.01567 0.04246 0.02155 0.1975 纯化倍数 1 2.7 1.4 12.6 回收率（%） 100 四、分离产物的电泳检测（见下页） 五、反应时间对产物浓度的影响 反应时间(min) 0 1 3 4 8 12 20 30 40 吸光度 0 -0.004 -0.008 -0.004 -0.004 -0.003 0.014 0.033 0.046 还原糖含量（μmol） 0 -0.119 -0.238 -0.119 -0.119 -0.0893 0.41667 0.982 1.369 反应时间对产物浓度的影响1.591.391.190.990.790.590.390.19-0.01010y = 0.0012x2 - 0.01xR2 = 0.9297还原糖含量（μmol）20反应时间(min)3040
理论上，随着反应时间的延长，生成的还原糖含量越高，曲线斜率较大，当反应到达某一数值后，随着反应时间的延长，生成还原糖的含量基本不变，曲线基本上与横轴平行。但
该曲线并不符合理论曲线，分析其原因，制备最初酶液时，稀释倍数太大，浓度太小，导致其酶学性质变化不明显。
六、PH值对蔗糖酶活性的影响 PH值 3.5 吸光度 0.040 还原糖含量（μmol） 1.190 4.0 0.070 2.083 4.5 0.101 3.006 5.0 0.108 3.214 5.5 0.083 2.470 6.0 0.030 0.8929 PH值对蔗糖酶活性的影响还原糖含量（μmol）3.5003.0002.5002.0001.5001.0000.5000.0003.04.05.0PH值6.07.0
由上图可知，随着PH值的升高，酶的活力不断增强。当PH值升高到某一数值后，随着PH值的升高，酶活力逐渐下降（事实上，PH值升高到某一数值后，蔗糖酶就会失活）。而且，由图表还可推断出，蔗糖酶的最适PH值为5.0左右。
七、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定 温度(℃) 40 50 60 70 80 吸光度 0.049 0.076 0.111 0.038 0.019 还原糖含量（μmol） 1.458 2.262 3.304 1.131 0.5655 酶活性（μmol/ min） 0.1458 0.2262 0.3304 0.1131 0.05655 温度对酶活性的影响0.3500酶活性（μmol/m）l0.30000.25000.20000.15000.10000.05000.0000204060温度(℃)80100
由上图可知，随着温度的升高，酶活性逐渐增强，当温度升高到某一数值后，酶活性随着温度的升高而降低（事实上，温度上升到某一数值后，酶已失活）。该酶的最适温度在60℃左右。
八、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数Km和最大反应速度Vmax的测定
管号 1 2 3 4 5 6 7 8 0.5M蔗糖(μl) 0 20 30 40 60 80 100 200 底物浓度(mol/l) 0.0025 0.00375 0.005 0.0075 0.01 0.0125 0.025 1/S(l/mol) 400 266.7 200 133.3 100 80 40 H2O(μl) 600 580 570 560 540 520 500 400 PH5.0buffer(μ200 200 200 200 200 200 200 200 l) 蔗糖酶(μl) 200 200 200 200 200 200 200 200 60℃酶促反应10min 0.4MNaOH(ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 DNS(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 100℃反应5min后,流水冷却,定容至25ml 0.011(舍A540 0 0.009 0.015 0.022 0.027 0.036 0.044 去) 还原糖含量(μg) 0 0.2679 0.4464 0.6548 0.8036 1.071 1.310 反应速度(μ 0.02679 0.04464 0.06548 0.08036 0.1071 0.1310 g/min) 1/V(min/μg) 37.33 22.40 15.27 12.44 9.333 7.636
Lineweaver-Burk图40.0030.00y = 0.1292x - 0.24882R = 0.9495
1/V(μg/min)20.0010.000.00-100.0-10.00-20.001/S(l/mol)0.0100.0200.0300.0由上图可知，横截距为1.926，由-1/Km=1.926可求得，Km =-0.5193mol/L。理论上，直线的横截距应为负值，纵截距应为正值。该数据明显为错误数据。但计算方法无误。导致错误的原因，很可能是原酶液稀释倍数太高，致使最后的计算结果发生错误。
九、尿素对蔗糖酶的抑制作用
管号 0.5M蔗糖(μl) 底物浓度(mol/l) 1/S(l/mol) 蔗糖酶(μl) PH5.0buffer(μl) H2O(μl) 酶促反应 0.4MNaOH(ml) DNS(ml) 脲为0时A540 还原糖含量(μg) 反应速度(μg/min) 1/V(min/μg) 脲为100时A540 还原糖含量(μg) 反应速度(μg/min) 1/V(min/μg) 脲为200时A540 还原糖含量(μg) 反应速度(μg/min) 1/V(min/μg) 脲为300时A540 还原糖含量(μg) 反应速度(μg/min) 1/V(min/μg) 1 0 0 200 200 600 1 2 -0.002 2 20 400 200 200 580 1 2 0.021 3 30 266.7 200 200 570 1 2 0.031 4 40 0.005 200 200 200 560 1 2 0.039 5 60 0.0075 133.3 200 200 540 1 2 0.046 6 80 0.01 100 200 200 520 1 2 0.061 7 100 0.0125 80 200 200 500 1 2 0.063 8 200 0.025 40 200 200 400 1 2 0.081 0.0025 0.00375 60℃酶促反应10min 100℃反应5min后,流水冷却,定容至25ml 0.6250 0.9226 1.161 1.369 1.815 1.875 2.411 0.06250 0.09226 0.1161 0.1369 0.1815 0.1875 0.2411 16.00 0.016 10.84 0.014 8.615 7.304 5.508 5.333 4.148 0.035 0.041 0.050 0.061 0.070 -0.05952 0.4762 0.4167 1.042 1.220 1.488 1.815 2.083 -0.005952 0.04762 0.04167 0.1042 0.1220 0.1488 0.1815 0.2083 -168 -0.001 21 0.011 / 0.020 9.6 8.195 6.72 5.508 4.8 0.029 0.040 0.041 0.030 0.061 -0.02976 0.3274 0.5952 0.8631 1.190 1.220 0.8929 1.815 -0.002976 0.03274 0.05952 0.08631 0.1190 0.1220 0.08929 0.1815 -336 -0.002 30.55 0.016 16.8 0.029 11.59 0.026 8.4 0.043 8.20 0.052 11.2 0.049 5.508 0.064 -0.05952 0.4762 0.8631 0.7738 1.280 1.548 1.458 1.905 -0.005952 0.04762 0.08631 0.07738 0.1280 0.1548 0.1458 0.1905 -168 21 11.59 12.92 7.814 6.462 6.857 5.25 Lineweaver-Burk图35.0030.0025.0020.0015.0010.005.000.00-200-100-5.00-10.00-15.001/V(mim/μg)-30001002003004005001/S(l/mol)
由上图可知，四条直线的纵截距大致相等，由此可推断，脲应为竞争性抑制剂，它和底物竞争与酶的结合。当脲与酶结合后，就妨碍了底物与酶的结合，减少了酶的作用机会，因而降低了酶的活力。
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